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在細(xì)胞培養(yǎng)中，血清作為不可-或缺的關(guān)鍵試劑，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)具有直接影響。因此，正確選擇和使用血清至關(guān)重要。
本期細(xì)胞學(xué)堂將全面探討血清的各個(gè)方面，深入分析選擇血清的考量要點(diǎn)，并探討血清在細(xì)胞培養(yǎng)中遇到的常見(jiàn)問(wèn)題，如血清的儲(chǔ)存和解凍、血清與微生物污染的關(guān)系、血清絮狀物析出的原因等，同時(shí)提供解決方案，助您的實(shí)驗(yàn)更順暢。
血清的簡(jiǎn)介及分類
血清是什么？
血清是指血液凝固后，從血漿中除去纖維蛋白原及某些凝血因子后分離出的淡黃色透明液體，或指已經(jīng)去除纖維蛋白原的血漿（見(jiàn)圖1）。在細(xì)胞培養(yǎng)中，動(dòng)物血清因其富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要，因此被廣泛應(yīng)用。
圖1. 全血、血漿和血清示意圖
血清的分類有哪些？
動(dòng)物血清根據(jù)動(dòng)物種屬的不同，可分為牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、豬血清等。其中，牛源血清尤為常見(jiàn)，且根據(jù)采血牛的年齡不同，可分為胎牛血清、新生牛血清、小牛血清和供體血清（見(jiàn)表1）。胎牛血清因其獨(dú)-特的優(yōu)勢(shì)，如低抗體水平和高生長(zhǎng)因子含量等，在細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，但其價(jià)格也相對(duì)較高。為了滿足多樣化的實(shí)驗(yàn)需求，市面上推出了多種類型的胎牛血清，如天然低IgG胎牛血清、干細(xì)胞專用胎牛血清以及透析型胎牛血清等。
表1 牛血清類別與胎齡對(duì)應(yīng)關(guān)系如下
No. | 牛血清類別 | 胎齡 |
1 | 胎牛血清（FBS） | 胎兒（母牛懷孕3-8個(gè)月） |
2 | 新生牛血清(NBS/NCS) | NBS嚴(yán)格：出生24 h內(nèi) NCS寬泛：出生14日內(nèi) |
3 | 小牛血清（CS） | 16-22周 |
4 | 供體血清 | 成年牛 |
血清在細(xì)胞培養(yǎng)中至關(guān)重要。鑒于不同實(shí)驗(yàn)對(duì)血清的需求不同，建議根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇適合的血清類型。必要時(shí)，也可針對(duì)特定細(xì)胞進(jìn)行血清篩選試驗(yàn)，以篩選出最-適合的血清。然而，近年來(lái)無(wú)血清培養(yǎng)基正逐漸興起。無(wú)血清培養(yǎng)基通過(guò)添加生長(zhǎng)因子等模擬血清功能，避免了血清的批次差異和潛在污染問(wèn)題，因此被認(rèn)為是未來(lái)細(xì)胞培養(yǎng)的必然趨勢(shì)。
血清的作用及選擇
血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的重要性不容忽視。它不僅是細(xì)胞生長(zhǎng)的必-備營(yíng)養(yǎng)成分，還對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)和功能有重要影響。其主要作用包括以下幾點(diǎn)：提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等；提供激素和各種生長(zhǎng)因子，支持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；提供結(jié)合蛋白，通過(guò)結(jié)合蛋白攜帶重要的低分子量物質(zhì)，確保它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)外正確傳遞；為細(xì)胞提供一定的保護(hù)作用，如防止外界環(huán)境的損傷，為細(xì)胞營(yíng)造一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。
在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，選擇適合的血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要。選擇血清時(shí)需綜合考慮以下因素：
細(xì)胞特性
不同類型的細(xì)胞對(duì)血清種類需求不同。大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)更適合使用牛血清，特別是胎牛血清（FBS）。但對(duì)于某些細(xì)胞，如MCF 10A、NK-92、PC-12（未分化）等，通常建議使用含有馬血清的培養(yǎng)基。此外，不同類型細(xì)胞對(duì)血清的濃度需求也有所不同。通常，血清使用的濃度范圍為10-20%，但對(duì)于某些細(xì)胞類型，如人支氣管上皮細(xì)胞、大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞等，常使用含2% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)需求
在選擇血清時(shí)，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體需求選擇合適的血清，特別是其營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子的種類及含量是否滿足所培養(yǎng)細(xì)胞的需求。有些類型細(xì)胞，除了添加血清外，還要格外添加生長(zhǎng)因子或抑制劑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)行為，如大鼠破骨細(xì)胞、小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞等。即使是同一細(xì)胞，如BEAS-2B細(xì)胞，其血清需求也會(huì)因?qū)嶒?yàn)需求的不同而有所變化。因此，是否使用含血清培養(yǎng)基需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求來(lái)決定。在含有血清的培養(yǎng)基中，BEAS-2B保留了對(duì)血清反應(yīng)進(jìn)行鱗關(guān)分化的能力，細(xì)胞在密度較低時(shí)呈長(zhǎng)梭型（見(jiàn)圖2），隨著密度的增加，形態(tài)會(huì)變短。相反，在不含血清的培養(yǎng)基（BEBM支氣管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基）中，BEAS-2B細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)典型的呼吸上皮細(xì)胞多邊形態(tài)（見(jiàn)圖3）。
圖2. BEAS-2B在DMEM培養(yǎng)基（含10%血清）
圖3. BEAS-2B在BEGM培養(yǎng)基（不含血清）中的培養(yǎng)
熱滅活的主要作用是降低血清中補(bǔ)體成分的活性，甚至使其完-全失活。在某些特定情況下，為避免補(bǔ)體蛋白干擾細(xì)胞生長(zhǎng)和功能，要使用熱滅活處理后的血清來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞[1-3]。然而，熱滅活過(guò)程可能導(dǎo)致血清中產(chǎn)生一些沉淀，消耗其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，通常不建議對(duì)血清進(jìn)行熱滅活。
血清品質(zhì)
不同廠家的血清來(lái)源、生產(chǎn)工藝和包裝運(yùn)輸?shù)榷加胁町?，建議選擇知-名品牌和質(zhì)量穩(wěn)定的血清。由于動(dòng)物血清的成分復(fù)雜，即使是同一廠家，不同批次之間的差異也可能會(huì)影響細(xì)胞的增殖和形態(tài)。如L-929細(xì)胞培養(yǎng)更換不同批次血清后，細(xì)胞形態(tài)有明顯差異（見(jiàn)圖4）。因此，建議選定血清品牌后，盡量避免更換，并適當(dāng)儲(chǔ)備同一批次的血清以減少批次差異對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)影響。如果必須要更換血清，建議采用梯度替換方法，逐步過(guò)渡，以減少對(duì)細(xì)胞的影響。具體操作如下：首先用25%新血清與75%原血清進(jìn)行混合，培養(yǎng)傳代1-2次；然后用50%新血清與50%原血清混合培養(yǎng)；接著用75%新血清與25%原血清混合培養(yǎng)；最后完-全使用新血清培養(yǎng)。
圖4. L-929細(xì)胞剛更換血清（左），一周后（右）
使用血清常見(jiàn)問(wèn)題分析
血清保存
血清通常需要在-20℃或-80℃條件下進(jìn)行長(zhǎng)期冷凍保存。若保存不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致血清質(zhì)量降低，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不良影響。對(duì)于每次使用量較少的情況，建議將解凍后的血清分裝并重新凍存，以避免因反復(fù)凍融而影響血清的品質(zhì)。解凍后的血清應(yīng)存放于2-8℃，并盡量在一個(gè)月內(nèi)使用完畢。
血清解凍
血清應(yīng)在2-8℃條件下緩慢解凍，以防止因溫度變化過(guò)快導(dǎo)致的品質(zhì)下降。在解凍過(guò)程中，應(yīng)定時(shí)輕輕搖勻，以確保溫度均勻分布，防止局部過(guò)熱，并盡量避免氣泡形成，從而減少沉淀的產(chǎn)生。
微生物污染
若血清被細(xì)菌、真菌或支原體等微生物污染，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。可通過(guò)檢查外包裝是否完好、將血清接種到培養(yǎng)基種觀察是否有菌落形成，或使用支原體檢測(cè)試劑盒等方法確認(rèn)血清是否被污染。一旦確認(rèn)血清被污染，由于其品質(zhì)已無(wú)法保證，因此不建議進(jìn)行任何處理后再繼續(xù)使用。因此，在使用血清的過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，防止微生物污染。
析出物
血清在解凍過(guò)程中可能產(chǎn)生析出物（見(jiàn)圖5），這些析出物可能呈現(xiàn)為小黑點(diǎn)或纖維樣沉淀。鏡下觀察有時(shí)會(huì)看到小黑點(diǎn)呈布朗運(yùn)動(dòng)。關(guān)于這些析出物的成因，存在多種說(shuō)法：有人說(shuō)是“黑膠蟲污染"，有人認(rèn)為是血清原蟲或被誤判為菌類污染。然而，更為普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，小黑點(diǎn)或纖維樣沉淀析出物其實(shí)是血清中某些成分，如纖維蛋白、磷酸鈣、膽固醇等析出。少量析出物一般不會(huì)影響血清的品質(zhì)，可在37℃溫度下輕微溶解（不建議加熱）。如血清中析出物較多，可通過(guò)離心（400 ×g，3 min）去除。
圖5. 血清融解時(shí)混勻 （左），血清靜置融解不混勻血清沉淀（中），血清靜置融解不混勻出現(xiàn)小黑點(diǎn)（右）
血清在細(xì)胞培養(yǎng)中扮演著不可-或缺的角色，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)具有直接的影響。因此，在選擇血清時(shí)，我們需要綜合考慮細(xì)胞特性、實(shí)驗(yàn)的具體需求以及血清品質(zhì)等多種因素，以確保選擇到適合的血清。同時(shí)，在使用血清的過(guò)程中，還需妥善保存和解凍，并嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，以防止血清被污染。
以上是關(guān)于血清的分類、選擇和使用常見(jiàn)問(wèn)題的介紹，更多細(xì)胞培養(yǎng)干貨，請(qǐng)持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專欄~
參考文獻(xiàn)
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